Sequenziamento del DNA

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DNA

L’acido desossiribonucleico è la molecola che conserva tutte le informazioni utili al funzionamento delle cellule (e a volte anche dei virus).


Negli organismi eucarioti il DNA si trova nel nucleo mentre negli organismi procarioti è presente nel citoplasma. Nel nucleo il DNA assume uno stato di iper avvolgimento dovuto al legame con delle proteine chiamate istoni. Il DNA nello stato super avvolto legato a queste proteine viene chiamato cromatina.


Il DNA è un polimero. I monomeri di questo polimero sono i nucleotidi. Ogni nucleotide è formato da uno zucchero a 5 atomi di carbonio (deossiribosio), una base azotata (può essere adenina, timina, guanina o citosina) e un gruppo fosfato.

Il DNA si presenta quasi sempre come doppio filamento di cui l’uno è il complementare dell’altro. I due filamenti stabiliscono tra loro, intrecciandosi, una forma tridimensionale a doppia elica. Si forma così uno scheletro laterale formato dalla successione di zucchero e gruppo fosfato alternati e legati con un legame covalente mentre le basi azotate si collocano nella parte centrale dell’elica dove stabiliscono dei legami a idrogeno con la base azotata complementare.

Che significa dire carbonio 5′?

Se noi immaginiamo la forma non circolarizzata del deossiribosio possiamo individuare un atomo di carbonio ad una estremità con un doppio legame con un atomo di ossigeno. Ecco quell’atomo di carbonio col doppio legame con l’ossigeno è per convenzione l’atomo di carbonio 1′.

Quando ciclizziamo questa struttura, cosa che normalmente succede quando introduciamo uno zucchero in soluzione acquosa e quindi anche all’interno della cellula, lo zucchero ciclizza, in questo caso abbiamo un pentoso (zucchero a 5 atomi di carbonio) che formerà gli angoli di un pentagono con i primi quattro atomi di carbonio mentre l’ultimo angolo del pentagono sarà formato da un atomo di ossigeno. L’atomo di carbonio fuori dal pentagono è il nostro simpatico 5′. In un nucleotide all’atomo di carbonio 5′ è legato il gruppo fosfato; all’atomo di carbonio 1′ è legata la base azotata.

La DNA polimerasi è un enzima capace di legare il fosfato (legato al carbonio 5′) di un nucleotide con il carbonio (in posizione 3′ del pentoso) di un altro nucleotide. In questo modo il DNA viene costruito procedendo sempre in direzione 5′ –> 3′ dato che la DNA polimerasi può lavorare solo in direzione 5′ –> 3′. All’inizio del filamento di DNA quindi a monte avremo l’estremità 5′ e ci troveremo un pentoso che lega un fosfato col carbonio in posizione 5′ e lega il pentoso dello zucchero successivo in posizione 3′. Alla fine del filamento di DNA cioè a valle troveremo l’estremità 3′ e potremo osservare un pentoso che lega un fosfato in posizione 5′. Questo fosfato lega anche il pentoso precedente in posizione 3′ mentre il pentoso terminale possiamo dire che ha il 3′ “libero”.

I due filamenti di DNA sono anti paralleli cioè hanno senso opposto cioè se immaginiamo due filamenti che si raffrontano in verticale se quello a sinistra dall’alto verso il basso ha senso 5′ –> 3′, quello a destra dal basso verso l’alto avrà vero 5′ –> 3′.

Progetto genoma umano

Il DNA contiene le informazioni per sintetizzare le proteine. Queste informazioni diventano accessibili tramite due passaggi: trascrizione e traduzione.

La trascrizione è il processo attraverso il quale si produce un singolo filamento di RNA a partire dal DNA. La traduzione è il processo attraverso il quale da un singolo filamento di RNA si forma una proteina.

Questa serie di processi per la estrapolazione dell’informazione in senso unidirezionale dell’informazione dal DNA alla proteina è chiamato dogma centrale della biologia e ad oggi sappiamo che esistono almeno due eccezioni.

Un segmento di DNA che contiene l’informazione per il controllo e lo sviluppo di un singolo carattere (esempio: colore degli occhi) o fenotipo è chiamato gene. Il genoma è l’insieme dei geni di un organismo.

Siamo 2011 quando viene completato il progetto genoma umano (Human Genome Project o HGP). Ci sono voluti 20 anni e 3 miliardi di dollari per portare a termine questo progetto che prevedeva l’identificazione e il sequenziamento dell’intero genoma umano. Una volta sequenziato il genoma è più semplice studiare la funzione dei singoli geni e studiare terapie molto più mirate per malattie che prevedono il malfunzionamento di geni specifici.

Oltre al genoma di Homo sapiens viene sequenziato il genoma di altre specie come il batterio commensale Escherichia Coli e Drosophila Melanogaster, il comune moscerino della frutta.

Le scoperte compiute da HGP sono state:

Non c’è una corrispondenza tra la complessità di un organismo, il numero di geni codificanti e la dimensione totale del genoma.

Anche se varia il numero di ORF (Open Reading Frames), ossia i tratti codificanti dei geni, il loro range di dimensione non fa lo stesso, ciò probabilmente è dovuto alla dimensione delle proteine che non può cambiare più di tanto, pena la perdita di funzionalità.

Con l’evoluzione aumenta la frammentazione dei geni che si manifesta con un accorciamento degli esoni e un allungamento degli introni.

Il procedimento

La prima operazione consiste nell’utilizzo di una tecnica chiamata PCR (Polimerase Chain Reaction o reazione a catena della polimerasi). Alla fine di questa procedura verranno ottenute moltissime copie del DNA che voglio analizzare.

A questo punto è necessario aumentare la temperatura che causa la separazione dei due filamenti di DNA; otterremo quindi dei filamenti di DNA single strand (ss o singolo filamento).

Alla miscela vengono aggiunte diverse molecole:


DNA polimerasi: enzima che ha la capacità di aggiungere nucleotidi ad un primer allungandolo;

Primer: oligo nucleotide prodotto specificatamente per il DNA da sequenziare. Senza il primer la DNA polimerasi è incapace di produrre un filamento di DNA;

Nucleotidi tri fosfato con le quattro basi azotate;

Nucleotidi modificati in 3’ dove manca il gruppo ossidrile. Inoltre è presente un’altra modifica cioè il nucleotide è legato ad un marcatore fluorescente. Il marcatore fluorescente è diverso per ogni base azotata.

Si avvia la sintesi di un nuovo filamento di DNA. La DNA polimerasi si lega al primer e lo allunga aggiungendo un nucleotide non marcato alla volta rispettando la regola di complementarietà del filamento stampo.

Quando viene inserito un nucleotide modificato la sintesi si arresta perché la mancanza del gruppo ossidrile in 3’ non permette il legame col nucleotide successivo. La DNA polimerasi a questo punto si stacca.

Abbiamo ottenuto un frammento di DNA a doppio filamento col l’ultimo nucleotide marcato.
L’inserimento del nucleotide modificato è casuale perciò anche la lunghezza del filamento ottenuto risulta casuale.

Questa sequenza di eventi avviene tantissime volte tante quante il numero di sequenze di DNA ottenute con la PCR perciò otterremo tantissimi frammenti di DNA di tutte le lunghezze possibili.

Si denatura nuovamente il DNA.
I singoli filamenti sono sottoposti a elettroforesi. I frammenti migrano con una velocità che è inversamente proporzionale alla loro lunghezza (i più corti sono più veloci).

Alla fine della corsa elettroforetica è presente un laser che eccita i marcatori fluorescenti legati ai nucleotidi modificati che emetteranno una luce diversa a seconda della base azotata.

La luce emessa dal marcatore fluorescente viene catturata da un rilevatore che registra una sequenza di nucleotidi (ogni luce è specifica per ogni base azotata).

La sequenza di nucleotidi ottenuta corrisponde al filamento di DNA complementare della sequenza di DNA che si voleva conoscere.

Per scandagliare un intero genoma è necessario frammentare il genoma ed eseguire la procedura sui singoli frammenti. I risultati sono elaborati da un software che ha la capacità di trovare i punti di sovrapposizione e quindi ricostruire la sequenza completa.